Vitamine-immagine credit arc institute.
Negli anni 1890, proprio mentre il mondo medico cominciava a comprendere che i microbi invisibili causavano malattie infettive, l’idea che la mancanza di un nutriente potesse essere letale era ancora più difficile da concepire.
Poi le prove iniziarono ad accumularsi. Il medico olandese Christiaan Eijkman notò che i polli nutriti con riso brillato sviluppavano una paralisi simile al beri-beri, curabile reintroducendo la pula nel riso. Fu il primo indizio che quella che oggi chiamiamo vitamina B1 fosse essenziale. Le navi militari perdevano un terzo dei loro marinai a causa dello scorbuto durante i lunghi viaggi. Somministrando loro agrumi, ricchi di vitamina C, i decessi si azzerarono.
Nei decenni successivi, i ricercatori iniziarono a cercare altri nutrienti essenziali che il corpo non è in grado di produrre da solo. Li chiamarono vitamine, e i “cacciatori di vitamine” che li identificarono salvarono milioni di vite, guadagnandosi oltre una dozzina di premi Nobel. Nel 1948, tutte le 13 vitamine classiche erano note.
Grazie a questa nuova comprensione, le vitamine sono state aggiunte alla nostra alimentazione e sono diventate ampiamente disponibili come integratori. Se da un lato questo ha avuto l’ovvio vantaggio di ridurre le carenze nutrizionali, dall’altro ha comportato una diminuzione dell’attenzione da parte della popolazione. Le vitamine sono diventate un prodotto acquistabile al supermercato senza una chiara spiegazione su quanto assumerne, perché assumerle o sul meccanismo alla base dei loro benefici. Esistono casi clinici di medici che somministrano cocktail vitaminici ai pazienti per diverse patologie, con risultati a volte positivi e a volte negativi. La letteratura scientifica è frammentaria, ma vi sono sufficienti spunti di speranza che lasciano intendere la presenza di un segnale importante.
Il nostro laboratorio vuole affrontare il tema delle vitamine in modo più sistematico. Nel nostro nuovo articolo pubblicato su Cell, ribaltiamo l’approccio tradizionale alla ricerca di cure. Invece di partire da una singola malattia e impiegare un decennio alla ricerca di una cura, partiamo da una terapia già sicura e accessibile e ci chiediamo: quali malattie genetiche può curare?
Uno screening genomico per le malattie curabili con le vitamine
Abbiamo iniziato con le vitamine B2 e B3 perché sono componenti comuni dei terreni di coltura cellulare e possono essere facilmente omesse o aggiunte. Sfruttando questa caratteristica, abbiamo eseguito screening CRISPR su scala genomica in cellule tumorali K562 in terreni di coltura con o senza una di queste vitamine del gruppo B. Abbiamo quindi consultato il database OMIM delle malattie monogeniche note per individuare i geni candidati che crescevano bene con la vitamina ma male senza di essa. Questo ha prodotto un elenco di decine di geni responsabili di malattie che potevano essere salvate da alti livelli di vitamina B2 o B3.
Per B2, il risultato principale è stato SLC52A2, un trasportatore di riboflavina le cui mutazioni causano la sindrome di Brown-Vialetto-Van Laere, una patologia già nota per essere trattabile con alte dosi di riboflavina. Un altro risultato principale, FLAD1, corrisponde anch’esso a una condizione responsiva alla riboflavina. La presenza di due controlli positivi noti proprio in cima alla nostra lista ci ha confermato la validità del modello.
Ma lo screening ha rilevato anche la presenza di GPX4, un enzima che previene un tipo di morte cellulare chiamato ferroptosi, il che è stato inaspettato. Abbiamo convalidato la connessione in colture cellulari e poi in un modello murino, in cui i topi con deficit di GPX4 sottoposti a una dieta carente di vitamina B2 hanno mostrato un declino motorio accelerato. Ciò ha rappresentato una nuovissima interazione tra vitamina e malattia.
NAXD e vitamina B3
Dallo screening per la vitamina B3, il risultato più rilevante è stato il gene NAXD. Le mutazioni in questo gene causano una malattia molto rara, non molti laboratori studiano NAXD ed era completamente nuovo per noi all’epoca. Ciò che abbiamo scoperto è davvero affascinante e ci ha condotto a un’indagine lunga anni e spesso impegnativa.
La proteina NAXD è un enzima metabolico deputato alla correzione di bozze. Centinaia di enzimi dipendono da NAD/NADH (trasportatori di elettroni per le reazioni di ossidoriduzione) per svariate funzioni, dalla produzione di energia di base alla riparazione del DNA. A volte, però, a causa di errori commessi da enzimi come la GAPDH o per via di un pH più basso e di una temperatura più elevata, il NADH si idrata erroneamente trasformandosi in NADHX. Se questo processo non viene corretto, il NADHX può ciclizzare in un prodotto di scarto chiamato NADHX ciclico. Questi metaboliti anomali possono bloccare in modo competitivo gli enzimi che normalmente utilizzano NAD e NADH.
Il compito di NAXD è quello di riconvertire NADHX in NADH utilizzabile, correggendo gli errori prima che causino danni. Se una persona non ha la funzione di NAXD, sviluppa una grave malattia neurosviluppale che spesso è fatale nella prima infanzia, sebbene la tempistica vari a seconda della mutazione.
Abbiamo prima convalidato i risultati dello screening in colture cellulari, scoprendo che le cellule con deficit di NAXD crescevano male in terreni di coltura carenti di vitamina B3 e che questo fenotipo veniva ripristinato da un’elevata concentrazione di B3. Tuttavia, le cellule tumorali in piastra non sono rappresentative di ciò che accade in un organismo vivente. Avevamo bisogno di un modello animale e non esisteva un modello murino della malattia da deficit di NAXD. Questo rappresentava un ostacolo importante per il settore.
Abbiamo utilizzato CRISPR per generare topi knockout con mutazioni frameshift nell’esone 2 di Naxd . I topi sono nati indistinguibili dai loro fratelli, ma nel giro di uno o due giorni le loro condizioni di salute sono peggiorate rapidamente.
Comprendere e invertire la malattia NAXD
È stata una sfida, ma abbiamo ottimizzato i metodi LC-MS per rilevare tutti i metaboliti rilevanti: NAD, NADH, R-NADHX, S-NADHX e NADHX ciclico. Nei topi knockout, abbiamo osservato un massiccio accumulo di ogni forma di NADHX in tutti i tessuti, mentre questi metaboliti erano praticamente non rilevabili negli animali di tipo selvatico.
Siamo rimasti particolarmente colpiti dalla scoperta che il NAD risultava specificamente ridotto nel cervello e nella pelle, ovvero nelle zone in cui la malattia si manifesta nei pazienti umani. Altri organi, come fegato, cuore e reni, presentavano un accumulo di metaboliti anomali, ma mantenevano i livelli di NAD. Stiamo ancora cercando di capire perché alcuni tessuti siano più vulnerabili di altri.
Analisi metabolomiche più approfondite su cervelli knockout e imaging MALDI-TOF hanno rivelato che i composti più drasticamente ridotti, oltre al NAD stesso, erano la serina e la fosfoserina. La deplezione di serina era più grave nelle regioni corticali del cervello. Tuttavia, il sequenziamento dell’RNA a singolo nucleo ha rivelato che i tipi cellulari più colpiti non erano i neuroni, bensì le cellule endoteliali cerebrali, le cellule murali e gli astrociti, ovvero i vasi sanguigni del cervello. Le cellule endoteliali mostravano una forte impronta di morte cellulare, completamente invertita dal trattamento con B3.
Questo ci ha riportato alla nostra domanda iniziale: la vitamina può davvero curare questa malattia?
Per prima cosa abbiamo testato cosa succede quando la si elimina completamente. Abbiamo sottoposto delle madri gravide a una dieta carente di vitamina B3. Con il cibo normale, circa un quarto dei cuccioli erano knockout, come previsto. Con la dieta carente, su circa 70 cuccioli, non è nato vivo nemmeno un solo cucciolo knockout.
Poi abbiamo provato l’opposto. Riuscire a far aumentare effettivamente una vitamina nei tessuti di un minuscolo cucciolo di topo appena nato è più difficile di quanto si possa pensare, e abbiamo impiegato più di un anno solo per risolvere questo problema. Ma quando ci siamo riusciti, con iniezioni intraperitoneali giornaliere di nicotinamide riboside (una forma di vitamina B3) a partire dalla nascita, il recupero è stato straordinario. I topi knockout erano indistinguibili dai loro fratelli a partire dal cinquantesimo giorno. Otto dei nove animali trattati hanno continuato a sopravvivere, con un miglioramento di oltre 40 volte della durata della vita. Ogni aspetto della malattia che abbiamo misurato è stato recuperato, compreso il peso corporeo, la patologia cerebrale e la morte cellulare.
Quando abbiamo ritardato il trattamento di soli due giorni, ovvero dal giorno 0 al secondo giorno postnatale, non si è riscontrato alcun beneficio. Ecco perché sosteniamo l’inclusione del test NAXD nei pannelli di screening neonatale.
Un nuovo quadro di riferimento per la biologia delle vitamine
Esistono segnalazioni di casi clinici in cui a pazienti affetti da NAXD sono stati somministrati integratori, tra cui la vitamina B3, e alcuni hanno mostrato un miglioramento. Si tratta di dati aneddotici, ma coerenti con quanto abbiamo riscontrato. La trasposizione del dosaggio corretto dai topi agli esseri umani richiederà un lavoro accurato, ma siamo ansiosi di condividere questi risultati con i pazienti e la comunità clinica il più rapidamente possibile.
Ci auguriamo inoltre che questo lavoro ispiri altri a riconsiderare le vitamine con occhi nuovi. Ci farebbe piacere avere altri che intraprendessero questa strada. Le nostre analisi hanno individuato decine di altre malattie che potrebbero rispondere alla terapia con vitamina B2 o B3, e abbiamo testato solo due degli oltre 50 micronutrienti conosciuti.
Più in generale, riteniamo che il settore dovrebbe pensare in modo più creativo alle terapie, non limitandosi a sviluppare farmaci, ma chiedendosi se ci siano aspetti di ciò che respiriamo o mangiamo che possiamo modificare per curare le malattie.
Un giorno, forse, il genoma di ogni neonato verrà sequenziato alla nascita e riceverà raccomandazioni dietetiche personalizzate in base al suo patrimonio genetico. Vediamo questo come la ripresa del lavoro dei primi ricercatori di vitamine, che applicano strumenti moderni per affrontare la questione di quali vitamine possano curare quali malattie e i meccanismi che ne sono alla base.
Fonte: Cell