Guarigione dei tendini-immagine:KGN@PB@CM promuove la differenziazione tenogenica delle TDSC in vitro.
La guarigione dei tendini è compromessa da un eccesso di specie reattive dell’ossigeno, dall’infiltrazione di cellule infiammatorie e da un’insufficiente differenziazione osteogenica durante il trattamento.
Il nuovo sistema, denominato KGN@PB@CM, combina diversi elementi avanzati. I nanoenzimi di blu di Prussia (PB) agiscono come potenti spazzini di specie reattive dell’ossigeno (ROS), mentre la kartogenina (KGN), una piccola molecola che promuove la migrazione delle cellule staminali e la differenziazione tenogenica, è caricata sul nucleo di PB. Per consentire il rilascio mirato nei siti infiammati, le nanoparticelle sono rivestite con membrane cellulari di macrofagi, che forniscono una capacità di target omologo. Infine, le nanoparticelle sono incorporate in un idrogel termosensibile di Pluronic F127/acido ialuronico (HA-F127) che rimane allo stato di sol a temperatura ambiente, ma gelifica rapidamente alla temperatura corporea, garantendo un rilascio locale prolungato.
“Il nostro obiettivo era quello di superare due ostacoli principali nella guarigione dei tendini: il persistente microambiente infiammatorio e la mancanza di un’efficiente rigenerazione dei tenociti. Progettando una nanopiattaforma rivestita di membrana macrofagica in grado sia di neutralizzare le specie reattive dell’ossigeno (ROS) che di rilasciare KGN, abbiamo creato un sistema sinergico che riprogramma le risposte immunitarie promuovendo al contempo direttamente la differenziazione specifica del tendine”, dice il Dott. Huan Li, Dipartimento di Ortopedia Articolare, Primo Ospedale Popolare di Changzhou, Terzo Ospedale Affiliato dell’Università di Soochow, Changzhou, Cina.
Esperimenti in vitro hanno confermato le capacità del sistema. Le nanoparticelle KGN@PB@CM hanno mostrato un’eccellente attività di scavenging dei ROS nei test DPPH e hanno protetto le cellule staminali derivate dai tendini (TDSC) dal danno ossidativo indotto dal perossido di idrogeno, come dimostrato dalla colorazione con DCFH-DA. La colorazione di vitalità cellulare e i test CCK-8 hanno dimostrato una buona citocompatibilità, mentre l’incorporazione di EdU ha rivelato una proliferazione delle TDSC significativamente aumentata nel gruppo KGN@PB@CM.
Ancora più importante, le nanoparticelle hanno modulato efficacemente la polarizzazione dei macrofagi. Quando i macrofagi RAW 264.7 sono stati stimolati con lipopolisaccaride (LPS) per creare un ambiente pro-infiammatorio, il trattamento con KGN@PB@CM ha ridotto significativamente l’espressione dei marcatori M1 (iNOS, CD86) e aumentato i marcatori M2 (CD206, Arg-1, IL-10) sia a livello di mRNA che di proteina. I test ELISA hanno confermato la ridotta secrezione delle citochine pro-infiammatorie IL-1β, IL-6 e TNF-α, insieme all’aumento delle citochine antinfiammatorie IL-10 e TGF-β1.”Questo passaggio dalla polarizzazione M1 a quella M2 è fondamentale per la transizione dall’infiammazione alla riparazione tissutale”, osserva il Dr. Yan.
Il team ha anche valutato l’impatto diretto sulle TDSC. La colorazione con immunofluorescenza e la qRT-PCR hanno rivelato che KGN@PB@CM ha significativamente aumentato l’espressione di marcatori tenogenici chiave, tra cui il collagene di tipo I (COL1), la tenomodulina (TNMD), la scleraxina (SCX) e il mohawk (MKX), rispetto a PB o KGN@PB da soli. “Il KGN rilasciato dalle nanoparticelle recluta cellule staminali endogene e ne guida la differenziazione in tenociti, mentre il nucleo di PB garantisce che lo stress ossidativo non ostacoli questo processo“, aggiunge il Dr. Li.
L’efficacia terapeutica è stata testata su un modello di lesione del tendine d’Achille nel ratto. Sono stati confrontati quattro gruppi: sham, modello non trattato, idrogel di controllo negativo (NC-gel) e idrogel caricato con KGN@PB@CM (NPs@gel). A 2 e 4 settimane dall’intervento chirurgico, l’analisi istologica (colorazione con ematossilina-eosina e tricromica di Masson) ha mostrato che il gruppo NPs@gel presentava fibre di collagene ben allineate, matrice extracellulare densa e punteggi istologici di Bonar significativamente inferiori rispetto ai gruppi modello e NC-gel. L’immunofluorescenza dei tessuti tendinei ha confermato una riduzione dei macrofagi M1 CD86+ e un aumento dei macrofagi M2 CD206+ nel gruppo NPs@gel, insieme a un’elevata espressione di COL1 e TNMD e una diminuzione di α-SMA (un marker di fibrosi).
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Il recupero funzionale è stato valutato mediante l’analisi dell’andatura CatWalk. I ratti trattati con KGN@PB@CM hanno mostrato un miglioramento dell’area dell’impronta della zampa, della lunghezza del passo e della pressione della zampa, con una riduzione della durata dell’oscillazione, parametri che si sono avvicinati a quelli degli animali sottoposti a intervento simulato entro la quarta settimana. I test biomeccanici hanno inoltre dimostrato che i tendini trattati con NPs@gel presentavano un carico di rottura, una resistenza alla trazione, una rigidità e un modulo di Young significativamente maggiori rispetto ai gruppi di controllo, indicando il ripristino dell’integrità meccanica.
L’esame istologico degli organi principali (cuore, polmoni, milza, fegato, reni) a 8 settimane non ha mostrato segni di infiammazione, necrosi o fibrosi, confermando un’eccellente biocompatibilità a lungo termine. “La nostra strategia di doppia modulazione, antinfiammatoria e protenogenica, offre una piattaforma completa per la riparazione dei tendini”, conclude il Dott. Yan. “Sebbene siano necessari ulteriori studi su modelli animali più ampi e un follow-up più lungo, questo idrogel nanocomposito biomimetico si dimostra molto promettente per la traslazione clinica, non solo per le lesioni tendinee, ma anche per altre condizioni in cui sono necessarie la modulazione immunitaria e la rigenerazione tissutale“.