Misura in situ della struttura proteica 3D all’interno di cellule eucariotiche vive

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Immagine: le proteine ​​target sono espresse all’interno di cellule sf9 , quindi misurate usando la spettroscopia NMR “in-cell”. L’analisi statistica unica con l’aiuto dell’inferenza bayesiana viene applicata per calcolare l’accurata struttura 3D delle proteine ​​con una precisione senza precedenti. Credito Tokyo Metropolitan University.

I ricercatori della Tokyo Metropolitan University hanno determinato con successo la struttura tridimensionale ad alta risoluzione delle proteine ​​all’interno delle cellule eucariotiche vive. Hanno combinato la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare “in-cell” (NMR), un sistema di bioreattore e algoritmi computazionali all’avanguardia per determinare per la prima volta strutture proteiche in ambienti intracellulari affollati.

 La tecnica promette approfondimenti sul comportamento intracellulare delle proteine ​​che causano malattie e nuove applicazioni di screening dei farmaci, consentendo la visualizzazione in-situ di come le proteine ​​rispondono agli stimoli biochimici.

Le cellule eucariotiche sono i mattoni di una vasta gamma di organismi, inclusi tutti i funghi, le piante e gli animali. La loro struttura interna è estremamente complessa e varia, con una complessa gerarchia strutturale e una vasta gamma di biomacromolecole distribuite attorno a una rete citoscheletrica. Ciò ha reso difficile vedere cosa fa ogni proteina all’interno delle cellule nel suo ambiente naturale, nonostante gli evidenti vantaggi biomedici di sapere ad esempio come reagisce una particolare proteina quando le cellule sono sottoposte a stimoli chimici, come le sostanze farmaceutiche.

Per affrontare questa sfida, un team della Tokyo Metropolitan University guidato dall’assistente Professore Teppei Ikeya e dal Professore Yutaka Ito ha applicato misure di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) a specifiche proteine ​​espresse all’interno di cellule di insetti coltivate sf9 , un ceppo di cellule originariamente derivate da un tipo di falena, larva ampiamente utilizzata per la produzione di proteine.

Il lavoro pionieristico con la NMR del team era già riuscito a delucidare le strutture proteiche ad alta risoluzione all’interno dei batteri (non eucarioti). Il problema con la semplice applicazione delle stesse tecniche alle proteine ​​in sf9 era dovuto a cellule che rappresentavano una concentrazione significativamente inferiore di proteine ​​bersaglio e una breve durata di vita delle cellule stesse, rendendo difficile la raccolta di spettri NMR multidimensionali di alta qualità per la spettroscopia nucleare ad effetto Overhauser (NOESY) che avrebbe fornito informazioni precise su come sono distanziati gli atomi all’interno delle singole molecole.

Pertanto, i ricercatori hanno combinato uno schema di misurazione NMR rapido basato su campionamento sparso, con metodi computazionali all’avanguardia che impiegano tecniche statistiche come l’inferenza bayesiana, metodi su misura per elucidare le strutture proteiche in modo efficiente sulla base di una quantità limitata di informazioni strutturali da spettri NMR in cellule con intrinseca sensibilità bassa. Un sistema di bioreattore era anche equipaggiato all’interno dell’apparato NMR che manteneva le cellule in uno stato sano durante le misurazioni.

Con questi nuovi dati, il team è stato in grado di delucidare la struttura 3D di tre proteine ​​modello con una risoluzione senza precedenti, con una precisione di 0,5 Angstrom (0,05 nanometri) per la posizione degli atomi della catena principale della proteina. In particolare, i ricercatori hanno identificato una conformazione significativamente diversa in una regione localizzata di una delle proteine ​​rispetto alla sua struttura di riferimento in soluzione diluita.

La differenza conformazionale tra proteine ​​”in cellule” e “in provette” è presumibilmente causata da interazioni non specifiche con altre molecole all’interno delle cellule. Sta diventando chiaro che queste interazioni contribuiscono alle funzioni biologiche delle proteine.

Fonte, EurekAlert


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