Immagine: Erik J. Sontheimer, Prof. del Therapeutics Institute at UMass Medical School. Credit: University of Massachusetts Medical School
La tecnica CRISPR / Cas9 per la modifica del genoma sta rapidamente rivoluzionando la ricerca biomedica, ma la nuova tecnologia non è ancora sicura, secondo alcuni ricercatori. La tecnica infatti, può inavvertitamente apportare modifiche eccessive o indesiderate nel genoma e creare mutazioni fuori controllo che limitano la sua sicurezza ed efficacia nelle applicazioni terapeutiche.
Ora, i ricercatori della UMass Medical School ( University of Massachusetts) e l’Università di Toronto hanno trovato la prima prova di queste “mutazioni fuori controllo” causate dall’attività di CRISPR / Cas9 e suggeriscono la necessità di maggiore controllo delle modifiche al genoma da esso causate.
Il nuovo studio è stato pubblicato dalla rivista Cell.
Erik J. Sontheimer, Prof. al Therapeutics Institute presso la UMass Medical School, Alan Davidson, Prof.di genetica molecolare e Karen Maxwell, Aassistente Prof. di biochimica presso l’Università di Toronto, hanno individuato tre mutazioni che si verificano nelle proteine che inibiscono l’enzima Cas9. Queste proteine, conosciute come anti-CRISPRs, hanno la capacità di bloccare il taglio del DNA della nucleasi Cas9.
“CRISPR / Cas9 è una buona tecnica perché produce rotture cromosomiche specifiche che possono essere sfruttate per creare le modifiche del genoma, ma la sua attività eccessiva o prolungata può far diventare queste rotture cromosomiche pericolose “, ha spiegato il DR. Sontheimer. “C’è attualmente una carenza nella conoscenza di modi affidabili per spegnere Cas9 una volta che è già stato consegnato a una cellula. Se riusciremo a trovare un interruttore per interrrompere la sua attività dopo un utilizzo corretto, allora il problema è risolto. Riportiamo di seguito, la prima nota sui naturali inibitori dell’ attività di Cas9 “.
“CRISPR è molto potente, ma dobbiamo essere in grado di gestire la sua attività”, ha affermato Davidson.
“CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeats, traducibile in italiano con “brevi ripetizioni palindrome raggruppate e separate a intervalli regolari“, è il nome attribuito a segmenti di DNA contenenti brevi sequenze ripetute, scoperti all’interno di cellule procariote (in passato, la terminologia era Short Regularly Spaced Repeats, abbreviato in SRSR). Ogni ripetizione è seguita da brevi frammenti di DNA “distanziatore” generati da una passata esposizione del batterio a virus batteriofagi o plasmidi. Le sequenze CRISPR sono state rinvenute in circa il 40% dei genomi batterici. La funzione biologica e l’importanza delle CRISPR sono state rivelate dalla scoperta dell’esistenza di un complesso di geni associati a tali sequenze, denominato Cas (contrazione di CRISPR-associated), in grado di codificare per presunte proteine di nucleasi ed elicasi, che sono enzimi in grado di tagliare il DNA. In questo modo, l’associazione CRISPR/Cas9 costituisce un sistema immunitario procarioto che conferisce resistenza nei confronti di elementi genetici estranei come plasmidi e fagi e provvede, quindi, a una sorta di immunità acquisita. Le sequenze “distanziatrici” dei CRISPR riconoscono e tagliano questi elementi estranei con un meccanismo analogo all RNA interference degli organismi eucariotici.
Per queste sue caratteristiche, il sistema CRISPR/Cas è stato usato per l’ingegneria genetica (aggiungendo, rimuovendo o cambiando la sequenza di geni specifici) e per la regolazione genica di molte specie. Portando la proteina Cas9 e gli appropriati RNA guida (gRNA) nelle cellule, il genoma dell’organismo può essere tagliato in qualsiasi punto in maniera estremamente precisa e con una tecnica semplice che richiede attrezzature relativamente economiche.
Inoltre, CRISPR è stato modificato per creare fattori di trascrizione programmabili che permettono di attivare o silenziare specifici geni“.
Gli scienziati possono riprogrammare il sistema CRISPR/Cas9 con RNA guida artificiale per tagliare le sequenze all’interno di genomi dei mammiferi e consentire l’inserimento preciso di nuovi frammenti di informazioni genetiche nelle cellule. Un modo semplice ed efficace di modificare il genoma: CRISPR / Cas9 sta cambiando la ricerca biomedica rendendo molto più facile inattivare o modificare i geni in una linea cellulare. Semplifica inoltre la creazione di modelli di malattia animali che possono essere utilizzati per studiare malattie umane. Un lavoro che può richiedere mesi o anni, ora può essere fatto in poche settimane.
Ma la potenza del sistema CRISPR / Cas9, ha un lato oscuro: ci sono momenti in cui l’RNA guida utilizzato per manovrare l’enzima di congiunzione nella posizione corretta all’interno del genoma si rivolge anche all’enzima di altre sequenze che sono simili, ma non identiche. Questi siti non corrispondenti, che possono verificarsi fino a 100 volte nei 6 miliardi di nucleotidi che compongono il genoma umano, a volte possono anche essere tagliati causando danni non intenzionali.
“CRISPR / Cas9 potrebbe rivolgersi correttamente alle cellule destinatarie del suo intervento, ma potrebbe anche rivolgersi ad altre cellule accessorie, tessuti o organi. L’attività di Cas9 in queste cellule accessorie, tessuti o organi è nella migliore delle ipotesi inutile e nella peggiore una rischio “, ha detto Sontheimer. “Ma se si potessimo progettare un interruttore che mantiene Cas9 inattivo ovunque, tranne che nel tessuto bersaglio, allora la specificità della tecnica potrà essere migliorata insieme alla sua sicurezza”.
“La nuova ricerca non solo identifica “mutazioni indesiderate che possono essere causate dall’attività di CRISPR/Cas9″, ha detto Sontheimer,” ma dimostra che gli inibitori Cas9 esistono naturalmente e possono essere identificati e sfruttati”.
“Ci sono molte diverse forme di Cas9 che sono prodotte da batteri diversi, e le diverse Cas9s possono ciascuna avere diverse proprietà utili a modificare il genoma”, ha aggiunto il ricercatore. “Quindi ci sono già diversi Cas9s nella casella degli strumenti da utilizzare nelle applicazioni biomediche, con molti altri a venire. Ora abbiamo dimostrato che tali inibitori sono là fuori nel mondo naturale e abbiamo fornito una strategia possibile per trovarli”.
Fonte: University of Massachusetts
