Prime Editing-Immagine credit public domain.
Scopri come il prime editing sta ridefinendo il futuro della medicina offrendo correzioni del DNA estremamente precise, sicure e versatili, aprendo la speranza di trattamenti più efficaci per le malattie genetiche e sollevando importanti questioni scientifiche ed etiche.
Introduzione
E se potessimo riscrivere il codice genetico di una singola cellula con precisione chirurgica? Il prime editing, il prossimo passo nell’ingegneria genomica, consente correzioni del DNA estremamente accurate senza danneggiare il codice genetico, aprendo la strada a terapie più sicure ed efficaci per le malattie genetiche.
Con l’evoluzione della tecnologia, il prime editing si dimostra promettente e promette di diventare un pilastro della medicina personalizzata. Questo articolo esplora i fondamenti del prime editing, le sue differenze rispetto ad altre tecnologie di editing genetico, i meccanismi sottostanti, le potenziali applicazioni mediche e le sfide scientifiche ed etiche che lo attendono.
Che cos’è il Prime Editing?
Introdotto nel 2019 da un team di ricercatori del Broad Institute presso il Massachusetts Institute of Technology e l’Università di Harvard, il prime editing si basa su brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente e intervallate (CRISPR), ridefinendo gli approcci terapeutici a vari disturbi genetici. 1
Il prime editing è una tecnica di editing genetico di nuova generazione progettata per correggere, inserire o eliminare sequenze specifiche di DNA senza causare rotture a doppio filamento o basarsi su modelli di DNA donato. Rispetto ai precedenti metodi di editing genomico come le nucleasi a dita di zinco (ZFN), le nucleasi effettrici simili ad attivatori di trascrizione (TALEN) e la proteina 9 associata a CRISPR (Cas9),il prime editing offre un’alternativa più precisa e flessibile con minori effetti off-target.
I sistemi CRISPR-Cas9 convenzionali modificano il DNA creando rotture a doppio filamento in punti genomici mirati, seguite da una riparazione cellulare attraverso la giunzione non omologa delle estremità o la riparazione guidata dall’omologia. Sebbene efficace, questo processo può causare inserzioni o delezioni indesiderate di DNA, note anche come indel, ed è principalmente limitato alle cellule in divisione .
Al contrario, il prime editing si basa sulla nickasi Cas9, un sistema CRISPR-Cas9 modificato, fuso con un enzima trascrittasi inversa in grado di identificare e successivamente sostituire sequenze specifiche di DNA con maggiore precisione e minor rischio. Dalla sua introduzione nel 2019 da parte di David Liu e colleghi, il prime editing è rapidamente diventato un obiettivo di ricerca intensiva, con diversi miglioramenti che ne hanno accresciuto l’efficienza e l’applicabilità in ambito terapeutico.
Descrizione grafica delle tecnologie di editing del genoma mediate da Cas9. 4
Come funziona il Prime Editing?
I prime editor (PE) sono costituiti da un sistema a tre componenti che include una nickasi Cas9, coniugata a una trascrittasi inversa ingegnerizzata e associata a un acido ribonucleico guida per il prime editing (pegRNA). Inizialmente, il pegRNA si legherà alla sequenza di DNA bersaglio tramite appaiamento di basi complementari, dopodiché la nickasi Cas9 intaccherà il filamento non bersaglio.
“Il pegRNA ha il duplice scopo di guidare la proteina PE verso il locus bersaglio e di codificare la modifica desiderata”.
Successivamente, il pegRNA utilizza il modello di trascrizione inversa per sintetizzare la sequenza di DNA desiderata nel sito di rottura. Vengono quindi avviati la legatura e la riparazione degli errori di appaiamento del DNA (MMR) per copiare le informazioni dal filamento modificato al filamento non modificato, ottenendo così la modifica desiderata nel genoma.
Vantaggi del Prime Editing
Il prime editing offre numerosi vantaggi rispetto ai precedenti strumenti di editing del genoma.
La versatilità del prime editing, ad esempio, consente tutte le 12 possibili conversioni base-base e supporta piccole inserzioni e delezioni , offrendo così un’immensa flessibilità per modifiche genomiche precise. Il prime editing è anche altamente preciso, il che riduce significativamente il rischio di mutazioni indesiderate ed effetti off-target rispetto a CRISPR-Cas9, rendendolo un’alternativa più sicura per le applicazioni terapeutiche.
Il prime editing può essere utilizzato sia in cellule in divisione che in cellule non in divisione, ampliando così la sua applicazione in tessuti come neuroni e cellule muscolari, precedentemente difficili da modificare. Questa tecnologia elimina inoltre la necessità di rotture a doppio filamento o di modelli donatori, riducendo al minimo lo stress cellulare e migliorando i risultati dell’editing.
Diagramma di flusso per la progettazione e l’applicazione del prime editing. Il prime editing viene utilizzato per trattare malattie genetiche con specifiche mutazioni patogene. Alcuni siti web possono aiutare a progettare una varietà di pegRNA e nsgRNA candidati, che vengono poi costruiti mediante la tecnica di assemblaggio Golden Gate. Successivamente, questi plasmidi vengono sottoposti a screening in vitro per selezionare i pegRNA e gli nsgRNA con le migliori prestazioni. Questi RNA ben performanti vengono quindi costruiti in un sistema a doppio AAV. Dopo l’iniezione nel modello murino, vengono infine valutati l’efficienza dell’editing e gli eventi off-target del prime editing.
Potenziali applicazioni in salute e medicina
Attualmente, il prime editing è oggetto di studio come nuovo approccio per il trattamento di malattie genetiche, cancro e malattie infettive.
“Questo strumento efficiente può correggere fino all’89% delle varianti genetiche precedentemente scoperte e associate a malattie umane”.
Malattie monogeniche
Il prime editing è stato ampiamente studiato in modelli preclinici sia in vitro che in vivo per correggere mutazioni genetiche responsabili della distrofia muscolare di Duchenne, dell’amaurosi congenita di Leber, della tirosinemia, del deficit di α1-antitripsina (AATD) e della fenilchetonuria. Sebbene numerosi prime editor (PE) siano stati studiati e abbiano fornito risultati promettenti, sono necessari ulteriori studi su modelli animali superiori prima che questa tecnologia possa essere valutata su soggetti umani.
Ricerca sul cancro
Chemioterapia, radioterapia e chirurgia sono le principali terapie utilizzate per il trattamento del cancro, oltre alle terapie ormonali e alle immunoterapie mirate, ove applicabili. Tuttavia, questi approcci sono associati a numerosi effetti collaterali indesiderati e critici, che giustificano lo sviluppo di strategie sicure e più mirate.
Diverse mutazioni genetiche sono state implicate nel cancro come causa principale della trasformazione di cellule non cancerose in cellule tumorali a causa di un’alterata espressione proteica. Tecnologie di editing genetico come CRISPR Cas9 e prime editing sono state ampiamente studiate per il loro potenziale nel correggere queste mutazioni maligne, nonché nell’indurre mutazioni correlate al cancro in modelli preclinici utilizzati per studiare nuove terapie.
Malattie infettive
Vi è un crescente interesse nell’utilizzo del prime editing per offrire resistenza alle infezioni virali o rimuovere i genomi virali integrati dal DNA dell’ospite, impedendo così la riattivazione del virus. Ciò potrebbe fornire immunità permanente o l’eliminazione del virus.
Genomica preventiva
Apportare modifiche precise al genoma solleva la possibilità di utilizzare il prime editing nelle cellule germinali o negli embrioni per creare cambiamenti che potrebbero essere ereditati. Tuttavia, queste applicazioni rimangono eticamente controverse e rigidamente regolamentate.10
Stato attuale della ricerca clinica
La maggior parte delle applicazioni di prime editing sono precliniche e, di conseguenza, limitate a modelli in vitro e in vivo. Tuttavia, l’editing ex vivo di cellule di pazienti seguito da trapianto ha offerto notevoli speranze per una futura traduzione clinica di successo.
Sfide e considerazioni etiche
Prima che il prime editing diventi una pratica standard, è necessario affrontare diverse problematiche scientifiche, tecniche ed etiche. Le grandi dimensioni dei PE rendono difficile la distribuzione tramite vettori virali, il che ha portato i ricercatori a studiare la potenziale utilità di piattaforme non virali e vettori ottimizzati per le applicazioni di prime editing .
Anche l’efficienza dell’editing varia significativamente a seconda della posizione del gene e del tipo di cellula. Per superare queste sfide, i ricercatori stanno attivamente sviluppando strategie per migliorare la progettazione del pegRNA, l’attività della trascrittasi inversa e l’ambiente diriparazione cellulaare.
L’uso improprio dell’editing genomico per scopi non terapeutici e il miglioramento di tratti genetici progettati rappresentano una preoccupazione etica fondamentale. Per affrontare queste problematiche, enti regolatori come la Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti stanno sviluppando quadri normativi per l’uso responsabile della tecnologia di prime editing.
Conclusioni
Il prime editing rappresenta uno strumento potente per l’ingegneria genetica.
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Sono necessarie ulteriori ricerche per continuare a far progredire le tecnologie di editing genetico, concentrandosi sull’aumento dell’efficienza, sul miglioramento della somministrazione del DNA e sul miglioramento della sicurezza. Un approccio interdisciplinare e un costante coinvolgimento del pubblico sono inoltre fondamentali per garantire che il prime editing sia utilizzato in modo sicuro ed etico.
Fonte: Trends in Biotechnology