Degenerazioni retiniche-Immagine credit public domain.
Le degenerazioni retiniche ereditarie (IRD) sono un gruppo di malattie genetiche che portano alla progressiva perdita della vista, poiché le cellule dell’occhio che percepiscono la luce, i fotorecettori, muoiono a causa di mutazioni nei geni necessari per il loro funzionamento e la loro sopravvivenza.
La terapia genica si è affermata come un approccio promettente, sostituendo o integrando i geni difettosi per preservare o ripristinare la vista.
Tuttavia, la maggior parte delle strategie di terapia genica esistenti è stata sviluppata e testata nelle fasi iniziali della malattia, lasciando un vuoto importante nel trattamento dei pazienti diagnosticati dopo che si sono già verificati danni significativi alla retina.
Ora, in uno studio pubblicato su Molecular Therapy, i ricercatori della Divisione di terapie sperimentali della retina presso la Facoltà di medicina dell’Università della Pennsylvania (Penn Vet) e i loro collaboratori hanno sviluppato un nuovo potente kit di strumenti per contribuire a colmare questa lacuna.
Guidato da Raghavi Sudharsan, Professore associato di oftalmologia sperimentale della Penn Vet, e da William A. Beltran, Professore di oftalmologia Corinne R. Henry Bower, il team ha sviluppato quattro nuovi promotori specifici per i fotorecettori. “Questi “brevi segmenti di DNA agiscono come ‘interruttori’ molecolari per attivare il gene terapeutico nelle cellule bersaglio, stimolando un’espressione genica forte e specifica nei fotorecettori a bastoncelli e coni anche nelle fasi intermedie o avanzate della malattia“, spiega Sudharsan, autore principale dello studio.
“La maggior parte dei promotori attualmente utilizzati è stata testata solo su modelli animali sani e le loro prestazioni spesso diminuiscono con la degenerazione della retina”, continua Sudharsan. “Al contrario“, afferma, “i promotori di nuova concezione sono stati selezionati in base alla loro capacità di attivare l’attività genica in retine che avevano già perso più della metà dei fotorecettori, rendendoli più pertinenti per gli stadi della malattia in cui i pazienti vengono frequentemente diagnosticati“. Nei confronti diretti, i nuovi promotori hanno superato il promotore GRK1, ampiamente utilizzato, sia in termini di forza di espressione che di specificità.
Questo studio affronta uno dei maggiori ostacoli nel trattamento dell’IRD: come somministrare una terapia genica efficace dopo che un’ampia porzione della retina è già degenerata. “Siamo rimasti particolarmente entusiasti delle prestazioni dei promotori basati su GNGT2 che hanno mostrato una forte espressione sia nei bastoncelli che nei coni, anche in stadi avanzati della malattia. E le loro dimensioni ridotte, inferiori a 850 paia di basi, li rendono ideali per il confezionamento di AAV [virus adeno-associati], a differenza di alcuni promotori conici convenzionali che sono significativamente più grandi”, dice Raghavi Sudharsan, professore associato di oftalmologia sperimentale presso la Facoltà di Medicina Veterinaria dell’Università della Pennsylvania.
Il team ha inoltre sottolineato che l’elevata specificità di questi promotori per i fotorecettori può aiutare a limitare gli effetti off-target e a ridurre le potenziali risposte immunitarie, considerazioni importanti per la sicurezza e l’efficacia a lungo termine.
I ricercatori hanno utilizzato una combinazione di analisi trascrittomica, modellazione in silico e screening in vivo in modelli di animali di grandi dimensioni per identificare una serie di nuovi promotori corti che rimangono attivi nei fotorecettori in degenerazione. Tra questi, i promotori derivati dai geni GNGT2, IMPG2 e PDE6, che hanno dimostrato una forte espressione cellula-specifica quando somministrati tramite AAV nelle retine di modelli canini che imitano le malattie neurodegenerative umane.
“Questi risultati evidenziano l’importanza di testare i promotori in modelli clinicamente rilevanti e nelle fasi appropriate delle degenerazioni retiniche, cosa che purtroppo non può essere stabilita in colture cellulari o organoidi retinici“, afferma l’autore senior William A. Beltran, che dirige la Divisione di Terapie Retiniche Sperimentali. “Essi gettano le basi per una nuova generazione di terapie geniche più potenti, precise e reattive alle esigenze cliniche reali dei pazienti con degenerazioni retiniche ereditarie, siano esse umane o animali“.
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L’Università della Pennsylvania ha depositato un brevetto provvisorio sulla tecnologia del promotore.
Spiegano gli autori:
“Le degenerazioni retiniche ereditarie (IRD) causano una progressiva perdita di fotorecettori, con conseguente compromissione della vista. La terapia genica basata su vettori virali adeno-associati (AAV) è estremamente promettente per il trattamento di queste condizioni. Tuttavia, raggiungere un’espressione genica ottimale nelle fasi medio-avanzate della degenerazione retinica rimane una sfida a causa della scarsità di promotori fotorecettoriali specifici ed efficienti, espressi in queste fasi della malattia. Questo studio mirava a identificare e validare nuovi promotori capaci di un’espressione transgenica robusta e specifica quando si perde ≥ 50% dei fotorecettori. L’analisi dei dati trascrittomici di due modelli canini di IRD, la microdissezione laser a cattura di criosezioni retiniche seguita da qPCR e l’ibridazione in situ dell’RNA hanno identificato sei geni promettenti con espressione sostenuta o sovraregolata nei fotorecettori nella malattia in fase avanzata. Gli elementi cis-regolatori a monte degli ortologhi canini e umani sono stati identificati e caratterizzati utilizzando analisi in silico e saggi a doppia luciferasi. Promotori corti (≤ 840 bp) derivati dai geni GNGT2 , IMPG2 e PDE6H hanno mostrato una robusta espressione del gene reporter nei fotorecettori quando somministrati tramite AAV nello spazio sottoretinico di due modelli canini non allelici di IRD in stadi intermedi e avanzati della malattia. Questi risultati forniscono una strategia per potenziare la terapia genica mediata da AAV consentendo un’espressione transgenica sostenuta nelle retine in degenerazione, migliorando i risultati del trattamento nei pazienti con progressiva perdita della vista”.
Abstract grafico
Abstract grafico credito Molecular Therapy.
William Beltran è Professore di oftalmologia Corinne R. e Henry Bower e Direttore della divisione di terapie retiniche sperimentali presso il dipartimento di scienze cliniche e medicina avanzata della facoltà di medicina veterinaria dell’Università della Pennsylvania. Raghavi Sudharsan è Professore associato di ricerca in oftalmologia sperimentale presso il Dipartimento di scienze cliniche e medicina avanzata della Penn Vet.
Altri autori sono Gustavo D. Aguirre, Aditi Ahuja, Natalia Dolgova, Valerie L. Dufour, Jennifer Kwok, Leonardo Murgiano, Yu Sato e Svetlana Savina della Penn Vet e Leah C. Byrne e Morgan Sedorovitz della Facoltà di Medicina dell’Università di Pittsburgh.
Fonte: Molecular Therapy