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CRISPR incontra Pac-Man: il nuovo strumento taglia e incolla DNA

 Immagine: NIH Image Gallery tramite flickr.com, CC0 Public Domain.

Uh nuovo sistema CRISPR-Cas3 adattato dagli scienziati UCSF utilizza un diverso sistema immunitario batterico. 

L’editing genico per lo sviluppo di nuovi trattamenti e per lo studio della malattia e del normale funzionamento negli esseri umani e in altri organismi, può avanzare più rapidamente con un nuovo strumento per tagliare pezzi più grandi di DNA dal genoma di una cellula, secondo un nuovo studio degli Scienziati della UC San Francisco.

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La pubblicazione dello studio della UCSF sulla rivista Nature Methods, arriva meno di due settimane dopo che due ricercatori che per primi hanno utilizzato le forbici genetiche note come CRISPR-Cas9 sono stati selezionati per ricevere il premio Nobel per la chimica di quest’anno.

Sebbene ora impiegato come strumento di ricerca nei laboratori di tutto il mondo, CRISPR si è evoluto nei batteri come mezzo per combattere la loro antica nemesi, un’intera schiera di virus noti come batteriofagi. Quando i batteri incontrano un fago, incorporano un po’ del DNA virale nel proprio DNA che funge da modello per produrre RNA che si lega al corrispondente DNA virale nel fago stesso. Gli enzimi CRISPR quindi mirano, disabilitano e uccidono il fago.

Nel suo ultimo lavoro che esplora questa antica e strana corsa agli armamenti, il ricercatore principale Joseph Bondy-Denomy, PhD, Professore associato presso il Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell’UCSF, si è unito agli scienziati Bálint Csörgő, PhD e Lina León per sviluppare e testare un nuovo strumento CRISPR.

Il già famoso insieme CRISPR-Cas9 è come uno scalpello molecolare che può essere utilizzato per asportare rapidamente e con precisione un piccolo frammento di DNA in un sito mirato. Altri metodi possono quindi essere utilizzati per inserire nuovo DNA. Ma il nuovo sistema CRISPR-Cas3 adattato dagli scienziati UCSF utilizza un diverso sistema immunitario batterico. L’enzima chiave in questo sistema, Cas3, agisce più come una cippatrice molecolare per rimuovere tratti di DNA molto più lunghi in modo rapido e accurato.

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“Cas3 è come Cas9 con un motore – dopo aver trovato il suo target specifico di DNA, agisce sul DNA e lo mastica come un Pac-Man (un videogioco ideato da Tōru Iwatani e prodotto dalla Namco nel 1980 che si basa su regole molto semplici: sfuggire ai fantasmini e mangiare le pillole disseminate lungo il labirinto) “, ha detto Bondy-Denomy.

Questa nuova capacità di eliminare o sostituire lunghi tratti di DNA consentirà ai ricercatori di valutare in modo più efficiente l’importanza delle regioni genomiche che contengono sequenze di DNA di funzione indeterminata, secondo Bondy-Denomy, una considerazione importante per la comprensione degli esseri umani e dei patogeni che li affliggono.

“In precedenza, non esisteva un modo semplice e affidabile per eliminare regioni molto grandi di DNA nei batteri per scopi di ricerca o terapeutici”, ha detto il ricercatore. “Ora, invece di fare 100 diverse piccole delezioni del DNA, possiamo solo fare una cancellazione e chiederci: ‘Cosa è cambiato?’ “.

“Poiché i batteri e altri tipi di cellule sono comunemente usati per produrre piccole molecole o farmaci a base di proteine, CRISPR-Cas3 consentirà agli scienziati del settore della biotecnologia di rimuovere più facilmente il DNA potenzialmente patogeno o inutile da queste cellule”, secondo Bondy-Denomy.

“Ampie fasce di DNA batterico sono poco conosciute, con funzioni sconosciute che in alcuni casi non sono necessarie per la sopravvivenza”, ha detto Bondy-Denomy. “Inoltre, il DNA batterico contiene grandi tratti di DNA importati da altre fonti, che possono causare malattie nell’ospite umano del batterio o deviare il metabolismo batterico. CRISPR-Cas3 dovrebbe anche consentire l’inserimento di interi geni nel genoma in applicazioni industriali, agricole o persino nella terapia genica umana”, ha detto Bondy-Denomy.

“I ricercatori dell’UCSF hanno selezionato e modificato il sistema CRISPR-Cas3 utilizzato dal batterio Pseudomonas aeruginosa e hanno dimostrato in questa specie e in altre tre, compresi i batteri che causano malattie negli esseri umani e nelle piante, che la loro versione più compatta funziona bene per rimuovere il DNA selezionato in tutte e quattro le specie. Altri sistemi CRISPR-Cas3 sono stati realizzati per funzionare in cellule umane e di altri mammiferi, e questo dovrebbe essere realizzabile anche per il  sistema P. aeruginosa modificato”, ha detto Bondy-Denomy.

Bondy-Denomy studia una serie di batteri, batteriofagi e sistemi CRISPR per saperne di più su come funzionano e per trovare strumenti molecolari utili. “CRISPR-Cas3 è di gran lunga il sistema CRISPR più comune in natura”, ha affermato. “Circa 10 volte più specie batteriche utilizzano un sistema Cas3 rispetto a un sistema Cas9. Può darsi che Cas3 sia un sistema immunitario batterico migliore perché distrugge il DNA dei fagi“.

I ricercatori hanno scoperto che a differenza di Cas9, quando Cas3 si lega al suo preciso bersaglio di DNA, inizia a masticare un filamento del DNA a doppia elica in entrambe le direzioni, lasciando un singolo filamento esposto. Le delezioni ottenute negli esperimenti UCSF variavano in termini di dimensioni, in molti casi comprendevano fino a 100 geni batterici. Il meccanismo CRISPR-Cas3 dovrebbe anche consentire una più facile sostituzione del DNA cancellato con una nuova sequenza di DNA.

Per la cancellazione e la modifica del DNA in laboratorio, gli scienziati programmano i sistemi CRISPR per indirizzare il DNA specifico nel genoma di un organismo di interesse utilizzando qualsiasi sequenza guida che scelgono.

Nel nuovo studio CRISPR-Cas3, manipolando le sequenze di DNA fornite ai batteri per riparare le delezioni, i ricercatori sono stati in grado di impostare con precisione i confini di queste grandi riparazioni del DNA, cosa che non sono stati in grado di realizzare con CRISPR-Cas9.

Bondy-Denomy ha scoperto in precedenza una strategie anti-CRISPR che i fagi si sono evoluti per combattere i batteri e queste potrebbero rivelarsi utili per fermare le reazioni di modifica genetica guidate dagli enzimi Cas usati come terapie umane prima che si manifestino effetti collaterali, o nell’uso del fago per rimuovere indesiderati batteri che hanno popolato l’intestino. A parte  E. coli  e un paio di altre specie, si sa relativamente poco sulle circa 1.000 specie batteriche che normalmente vi risiedono.

“I microbi non modello sono stati in gran parte lasciati indietro nel mondo della genetica e c’è un enorme bisogno di nuovi strumenti per studiarli”, ha detto Bondy-Denomy.

Credito immagine: UCSF

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