Autofagia- Immagine credit kateryna Kon.
L’editing genetico di precisione è fondamentale per il trattamento delle malattie genetiche, poiché consente la correzione mirata di mutazioni specifiche. Un team di ricerca coreano è diventato il primo al mondo a migliorare significativamente la scarsa efficienza di un meccanismo chiave di editing genomico, noto come ricombinazione omologa (HR), inducendo l’autofagia, un processo naturale all’interno delle cellule.
Il team del Dott. Hye Jin Nam presso il Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT), in collaborazione con i Professori Dong Hyun Jo e Sangsu Bae della Facoltà di Medicina della Seoul National University, ha scoperto che l’induzione dell’autofagia tramite privazione di nutrienti o inibizione di mTOR aumenta significativamente l’efficacia dell’editing genetico CRISPR-Cas9 basato su HR fino a tre volte. La tecnica è stata inoltre validata con successo in cellule derivate da pazienti portatrici di mutazioni genetiche e in modelli animali vivi, segnando un passo importante verso l’applicazione di questo metodo in ambito terapeutico.
La tecnologia CRISPR–Cas9 funziona creando rotture a doppio filamento (DSB) nel DNA per consentire l’editing genetico. Tuttavia, la maggior parte di queste rotture viene riparata attraverso un processo soggetto a errori chiamato giunzione delle estremità non omologhe (NHEJ), che spesso introduce mutazioni indesiderate. Al contrario, la ricombinazione omologa (HR) è una forma più accurata di riparazione del DNA, ma si verifica raramente, rendendo difficile l’editing di precisione. Precedenti tentativi di migliorare l’attività della HR, come la modulazione del ciclo cellulare o l’inibizione della NHEJ, sono stati limitati dalla tossicità e dalla scarsa compatibilità tra sistemi diversi.
Sospettando che l’autofagia potesse promuovere l’uso dell’HR rispetto a percorsi di riparazione soggetti a errori, il team di ricerca ne ha studiato l’effetto sull’editing genetico. Quando l’autofagia veniva innescata, sia da carenza di nutrienti che da trattamento con inibitori di mTOR, l’efficienza dell’editing basato sull’HR aumentava da 1,4 a 3,1 volte su vari geni bersaglio e dimensioni degli inserti di DNA. Al contrario, le cellule incapaci di autofagia non mostravano tale miglioramento, evidenziando il ruolo essenziale dell’autofagia nel promuovere una riparazione precisa del genoma.
Anche versioni alternative di CRISPR, come la nickase Cas9 (nCas9) e la dead Cas9 (dCas9), hanno mostrato prestazioni di editing migliorate in condizioni autofagiche. Ciò suggerisce che la strategia sia ampiamente applicabile su diverse piattaforme di editing genetico. Ulteriori analisi hanno rivelato che l’autofagia ha migliorato l’accumulo di proteine di riparazione del DNA associate a HR all’interno del complesso Cas9, il che potrebbe contribuire a indirizzare l’attività di riparazione verso risultati più precisi.
In esperimenti condotti su cellule derivate da pazienti portatrici di mutazioni nel gene MPZL2, correlate alla perdita dell’udito, il metodo ha portato a un aumento dell’espressione del gene corretto fino a tre volte. Il team di ricerca ha inoltre testato l’approccio su modelli murini. Quando l’editing genetico è stato eseguito sulla retina di topo, l’induzione dell’autofagia ha portato a un miglioramento di circa tre volte dell’efficienza dell’editing. Ciò conferma che la strategia funziona non solo nelle cellule in coltura, ma anche negli organismi viventi.
Questo studio è il primo a dimostrare che l’autofagia può migliorare l’accuratezza dell’editing genomico sia nelle cellule umane che nei modelli animali. I risultati suggeriscono una nuova strada per le terapie geniche, offrendo un modo più sicuro ed efficace per riscrivere con precisione le sequenze genetiche difettose.
Spiegano gli autori:
“Grazie alla sua praticità e all’elevata efficienza, il sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)–Cas9 (CRISPR-associated protein 9) è stato saldamente affermato come strumento per l’editing del DNA inducendo rotture a doppio filamento del DNA (DSB) in siti genomici specifici. Questo sistema coinvolge una proteina Cas9 endonucleasi del DNA e un singolo RNA guida (sgRNA), che genera DSB in una regione genomica bersaglio in modo RNA-dipendente. Il risultato primario previsto riguarda la riparazione del DNA attraverso l’unione delle estremità non omologa (NHEJ), che potenzialmente porta all’introduzione di piccole inserzioni o delezioni (INDEL) e all’interruzione dei geni bersaglio tramite mutazioni frameshift. Inoltre, la riparazione del DNA può avvenire attraverso la ricombinazione omologa (HR) che richiede l’uso di DNA donatore con bracci di omologia per un editing preciso, che mira a ottenere la correzione genica desiderata. Tuttavia, le frequenze di editing guidate da HR sono significativamente inferiori alle frequenze INDEL guidate da NHEJ. La bassa frequenza di HR deriva dalla sua incidenza predominante durante le fasi S e G2 del ciclo cellulare e dal suo requisito di prossimità del DNA donatore al sito DSB.
Per migliorare l’efficienza dell’HR, sono stati esplorati vari metodi, tra cui l’inibizione del percorso NHEJ, la modulazione del ciclo cellulare, il collegamento del DNA del donatore con Cas9 e l’impiego di piccole molecole per stabilizzare le proteine correlate all’HR. Sebbene il target delle proteine correlate all’NHEJ per interrompere i meccanismi di riparazione dell’NHEJ sia un approccio promettente, potrebbe inavvertitamente influenzare i normali processi di riparazione del DNA intracellulare e l’integrità del genoma. Allo stesso modo, l’arresto intenzionale del ciclo cellulare utilizzando composti chimici come il nocodazolo potrebbe portare ad alterazioni significative nella funzione cellulare. Inoltre, il metodo di collegamento del DNA del donatore con Cas9 pone delle sfide quando applicato agli esperimenti di editing genetico in vivo. Collettivamente, è quindi necessario esplorare e sviluppare strategie alternative per aumentare l’efficacia dell’HR.
L’autofagia è un processo omeostatico cellulare intrinseco che coinvolge la degradazione dipendente dai lisosomi per eliminare organelli e proteine non necessari o disfunzionali. In risposta alla carenza di nutrienti, le cellule riciclano organelli e proteine cellulari per generare energia attraverso l’autofagia. Inoltre, l’autofagia svolge un ruolo critico nell’eliminazione e nel riciclaggio dei componenti disfunzionali indotti da fattori di stress, come lo stress ossidativo, l’aggregazione proteica e il danno mitocondriale. È interessante notare che l’instabilità genomica tende ad accumularsi nelle cellule con deficit di autofagia. Numerosi studi hanno evidenziato il ruolo critico dell’autofagia nei processi di riparazione dei DSB. In particolare, l’assenza di autofagia compromette significativamente la riparazione del DNA mediata da HR, portando a una maggiore dipendenza dall’NHEJ per riparare i DSB a causa della maggiore degradazione del checkpoint chinasi 1. La degradazione di HP1α mediata dall’autofagia promuove un’efficiente riparazione dei DSB mediata da HR. Inoltre, diversi fattori chiave di riparazione del DNA associati a HR, tra cui BRCA1, RAP80 e RAD51, non vengono reclutati nel sito dei DSB del DNA nelle cellule con deficit di autofagia.
Tuttavia, per quanto a nostra conoscenza, nessuno studio precedente ha rivelato una correlazione quantitativa dettagliata tra autofagia ed editing genico basato su CRISPR-Cas9 indotto da HR. In questo studio, abbiamo ipotizzato che le condizioni autofagiche cellulari possano migliorare efficacemente la riparazione del DNA mediata da HR, seguita dai DSB mediati da Cas9. Inoltre, la scoperta e la sovraespressione di proteine cofattoriali correlate all’autofagia possono aumentare la riparazione del DNA mediata da HR. Abbiamo scoperto che l’induzione dell’autofagia, attraverso carenza di nutrienti o trattamento chimico, ha migliorato significativamente l’integrazione mediata da HR delle sequenze di DNA del donatore in vari loci genomici nelle cellule di mammifero. Inoltre, abbiamo identificato i cofattori correlati all’autofagia necessari per l’editing genico associato a HR e confermato che l’induzione dell’autofagia potrebbe anche essere utile per migliorare l’editing genico associato a HR in vivo nei topi“.
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“Sfruttare l’autofagia per migliorare la ricombinazione omologa rappresenta una strategia rivoluzionaria per superare le principali limitazioni delle attuali tecnologie di editing genetico”, dice la Dott.ssa Hye Jin Nam, Istituto coreano di ricerca sulla tecnologia chimica
Il Presidente del KRICT, Young-Kuk Lee, ha aggiunto: “Questo risultato migliora significativamente sia l’efficienza che la sicurezza dell’editing del genoma e segna un’importante pietra miliare nel progresso delle terapie di precisione”.
Questo lavoro è stato pubblicato su Nucleic Acids Research (IF: 16.7) nell’aprile 2025.